Студопедия — Простые и сложные методы окраски

Студопедия — Простые и сложные методы окраски

Методы окраски бактерий микробиология

Окр а ска микроорган и змов, один из широко применяемых методов микробиологической техники, заключающийся в окраске фиксированных клеток микроорганизмов специальными красителями. Вначале в каплю воды, находящуюся на предметном или покровном стекле, наносят петлей клетки микроорганизмов. После высушивания взвеси клеток препарат фиксируют специальными фиксирующими жидкостями. Для выяснения морфологии клеток их окрашивают спиртовыми растворами основных (метиленовый синий, генциановый фиолетовый, фуксин) или кислых (эритрозин, эозин) красителей. Существуют специальные методы окраски спор или жгутиков у бактерий, а также слизистых капсул у некоторых микроорганизмов. Очень распространена окраска по Граму, имеющая диагностическое значение (см. Грама метод). Кокковые и спороносные формы бактерий, а также дрожжей — грамположительны и окрашиваются в синий цвет, многие неспороносные бактерии — грамотрицательны и окрашиваются в красный цвет.

Некоторые красители или химические реактивы применяют для микроскопического химического анализа, т. е. обнаружения в клетках определённых органических веществ. Так, содержащиеся в клетках липиды окрашиваются осмиевой кислотой в чёрный, а суданом в красный цвет; метахроматин выпадает в вакуолях в виде красных зёрен при окраске нейтральным красным; раствор Люголя окрашивает крахмал в коричневый, а гранулёзу в синий цвет. Кислотоустойчивые бактерии (например, микобактерии, в частности вызывающие туберкулёз у человека и животных, а также возбудитель проказы) после окраски их фуксином в красный цвет не обесцвечиваются раствором серной кислоты. Весьма распространено витальное, т. е. прижизненное окрашивание нефиксированных клеток микроорганизмов. Употребление флюоресцентных красителей (например, акридинового оранжевого) в сочетании с люминесцентной микроскопией позволяет различать живые и мёртвые клетки микроорганизмов: первые окрашиваются в зелёный, вторые — в красный цвет.

Широкое распространение получили флюоресцентные красители, соединённые с сывороткой, содержащей антитела против микроба определённого вида. При люминесцентной микроскопии свечением обладают лишь клетки этого вида. Таким образом можно без посевов на питательной среде быстро установить вид болезнетворного микроба, содержащегося в кишечнике, крови или мокроте больного, а также виды микроорганизмов, присутствующих в почве.

Занятие 3. Сложные методы окрашивания. Окраска по Граму и Циль-Нильсену (кислотоустойчивых микроорганизмов).

Цель занятия.Овладеть методами окраски по Грамму и Циль-Нильсену.

Материалы и оборудование.Пробирки со взвесями бактерий (сальмонелл, стафилококков, эшерихий, вакцинного штамма сибирской язвы, атипичных микобактерий), спирт, раствор Люголя, генцианвиолет, фуксин Циля, 5% раствор серной кислоты, синька Леффлера, таблицы методов окраски.

СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАШИВАНИЯ

Сложные методы окраски основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки. Сущность этих методов заключается в воздействии на мазок двух красящих веществ, из которых одно является основной, главной краской, а другое дополнительной — контраст. После воздействия первой краской мазок обесцвечивают и только после этого подвергают дополнительной окраске. В качестве обесцвечивающих веществ может быть применен целый ряд химических реагентов (кислоты, щелочи, спирт, ацетон и др.). Обмывание мазка простой водой также является в какой-то степени чисто механическим процессом обесцвечивания, но для этого необходимо продолжительное время; кроме того, обесцвечивание получается неполное. По отношению к обесцвечивающим веществам можно разбить микробов на группы легко и трудно обесцвечиваемых, Не все виды микробов одинаково относятся к обесцвечивающим реагентам; некоторые являются кислото — и спиртоустойчивыми, другие только кислотоустойчивы. Наконец, некоторые, как, например, споры, энергично противостоящие воздействию всех обесцвечивающих веществ, относятся к группе краскоустойчивых.

Сложные методы окраски имеют важное дифференциально-диагностическое значение для характеристики изучаемого микроба.

Окрашивание по Граму. Этот метод позволяет все микроорганизмы разделить на две группы: грамположительные (гр+) и грамотрицательные (гр–).

Читайте также:  Кандид от стоматита �� Как применять капли Кандид при стоматите у детей

Техника окраски:

На фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги пропитанной 1%-ым спиртовым раствором генцианвиолета. Наносят на бумажку 2-3 капли воды. Окрашивают 2-3 минуты.

Бумажку снимают и не промывая препарата водой, наносят раствор Люголя на 2 минуты.

Сливают раствор Люголя и препарат обрабатывают 96%-ным этиловым спиртом в течение 20-30 секунд.

Тщательно промывают мазок водой.

Окрашивают мазок фуксином Пфейффера в течение 2-3 минут.

Препарат промывают водой.

Высушивают и микроскопируют.

Грамположительные микроорганизмы окрашиваются в фиолетовый цвет, а грамотрицательные — в розовый. Сущность окраски по Граму состоит в том, что отношение к краскам зависит от химического состава клетки и структурных особенностей клеточной стенки (наличие муреина и частично липида). В составе клеточной стенки грамположительных микроорганизмов большое количество муреина, воздействие этиловым спиртом вызывает разбухание муреина, что приводит к уменьшению диаметра пор и снижению проницаемости клеточной стенки. Поэтому не происходит вымывания красителя и обесцвечивания микробной клетки. В клеточной стенке грамотрицательных микроорганизмов муреиновый слой меньших размеров, диаметр пор больше и спирт легко проходит через клеточную стенку, вымывая краситель. Микробная клетка принимает цвет дополнительного красителя (красный). Кроме того, в поверхностном слое грамположительных микроорганизмов находиться магниевая соль рибонуклеиновой кислоты, которая в присутствии йода в кислой среде образует прочное соединение с основными красителями. Это так же препятствует обесцвечиванию их спиртом.

Пример: Escherichiacoli (кишечная палочка) иSalmonellacholeraesuis(возбудитель сальмонеллеза свиней) — грамотрицательные и окрашиваются в розово-красный цвет.Listeriamonocitogenes(возбудитель листериоза),Streptococcusecqui(возбудитель мыта) — грамположительные и окрашиваются генцианвиолетом в фиолетовый цвет.

Простые и сложные методы окраски

Выделяют простые и сложные методы окраски.

Простыми методами окрашивания называют окрашивание препаратов каким-либо одним красителем. Некоторые микроорганизмы (спирохеты), плохо выявляемые с помощью позитивных красителей, легко выявляются при окрашивании негативными красителями.

Техника приготовления препарата заключается в следующем. Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки (мостик), которые лежат над кюветой. На мазок наносят с помощью капельницы 1 % водный раствор фуксина или метиленового синего на 1–2 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания раствор красителя не подсыхал. После завершения окрашивания, краситель сливают. Препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая воде не станет бесцветной. Затем препарат высушивают. Для этого нижнюю сторону препарата промокают фильтровальной бумагой, а верхнюю сторону осторожно обсушивают с боков, не дотрагиваясь до мазка. Препарат окончательно досушивают на воздухе или высоко над пламенем спиртовки. Для получения более чистых препаратов краситель наносят на мазок, покрытый фильтровальной бумагой. Метод окрашивания в модификации Синева позволяет использовать вместо раствора красителя заранее пропитанную им фильтровальную бумагу. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки. Микроскопируют препараты с иммерсионной системой.

Присложных (дифференцирующих) методах окрашивания на один и тот же препарат воздействуют несколькими красящими веществами, одно из которых называется основным, другие – дополнительными. Кроме красителей используются различные обесцвечивающие вещества: спирты, кислоты, ацетон и др. С помощью сложных методов окрашивания выявляют цитологические особенности клеток микроорганизмов (клеточные структуры, включения и т. д.).

Окраска по методу Грамаявляется самым универсальным из сложных методов окраски. Окраска положена в основу дифференциации бактерий и отражает способность клеток воспринимать и удерживать внутри клетки красящий комплекс генцианового фиолетового и йода либо терять его после обработки спиртом. Соответственно выделяют грамположительные (Bacillus, Clostridium, Streptococcus, Lactobacillus, etc.) и грамотрицательные (Escherichia, Pseudomonas, Erwinia, Neisseria, etc.) формы.

Читайте также:  Противозачаточные таблетки и алкоголь совместимость с гормональными контрацептивами, отзывы

Для получения достоверных результатов необходимо готовить мазки для окраски по Граму из молодых, активно растущих (обычно односуточных) культур, так как клетки из старых культур иногда дают неустойчивую реакцию по Граму. Грамотрицательные бактерии могут выглядеть как грамположительные, если бактериальная пленка (мазок) слишком толста и обесцвечивание спиртом не проведено до конца. Грамположительные бактерии могут выглядеть как грамотрицательные, если мазок переобесцвечен спиртом.

Сущность метода. На поверхности цитоплазмы клетки у грамположительных микроорганизмов располагается комплекс из белка и рибонуклеата магния, отсутствующий у грамотрицательных бактерий. При окрашивании по Граму на поверхности грамположительных клеток образуется прочный комплекс из белка, рибонуклеата магния, генцианвиолета и йода, не разрушающийся при обработке спиртом. Такие бактерии остаются окрашенными в сине-фиолетовый цвет. Грамотрицательные бактерии не обладают свойством удерживать краску и при обработке спиртом обесцвечиваются. Для выявления их препарат докрашивают фуксином. При этом грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.

Этапы дифференцированного окрашивания по Граму:

1 Фиксированный мазок покрывают кусочком фильтровальной бумаги (1,5 х 1,5 см) и на него до полного смачивания наносят карболовый раствор генцианового фиолетового или кристаллический фиолетовый (чаще используют модификацию Синева). Окрашивание проводят на протяжении 1–2 мин.

2 Бумажку снимают, краситель сливают и, не промывая препарат водой, наносят на препарат раствор Люголя на 1–2 мин до почернения мазка.

3 Сливают раствор Люголя, окрашенный мазок обесцвечивают 96º этиловым спиртом. Для этого препарат 2–3 раза помещают в стакан со спиртом до прекращения отхождения фиолетовых струек (время обесцвечивания – не более 30 с), либо наливают 2–4 капли спирта на мазок на 30–45 с.

4 Препарат быстро промывают водой (как описано выше).

5 Мазок дополнительно окрашивают на протяжении 1–2 мин водным раствором фуксина (фуксин Пфейффера).

6 Краситель сливают, препарат промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой.

7 Микроскопируют с иммерсионной системой.

Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные – в розовый.

Нуклеоид. Обнаружить нуклеоид в бактериальной клетке при помощи светового микроскопа трудно. Для избирательного окрашивания нуклеоида фиксированные клетки предварительно обрабатывают рибонуклеазой или разбавленной соляной кислотой, чтобы разрушить рибосомальную РНК. Последующее окрашивание основным красителем позволяет выявить нуклеоид в виде плотных тел с неправильными очертаниями, расположенные в центре или на полюсах клетки.

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Нильсена отражает особенности микобактерий и нокардий.

Принцип метода. Кислотоустойчивость этих бактерий связана с высоким содержанием липидов в клеточной стенке. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются карболовым фуксином Циля при нагревании препарата в красный цвет и сохраняют эту окраску после обесцвечивания серной кислотой. Некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются кислотой и в последующем докрашиваются метиленовым синим в синий цвет.

Для выявления капсул пользуются различными методами, среди которых можно отметить метод Бурри и Бурри-Гинса. В основе метода лежит негативное контрастирование. Так как капсула или тело микробной клетки не воспринимает красители, тушью окрашивается лишь фон микропрепарата. Капсула видна как неокрашенная зона на темном фоне тушевого мазка. По методу Бурри-Гинса тела микробных клеток дополнительно окрашиваются в красный цвет фуксином.

Для окрашивания жгутиков предложено несколько методов, общим этапом для которых является протравливание препарата (обычно растворами таннина, KAl(SO4)2, HgCl2) и последующая окраска (чаще карболовым раствором фуксина). В результате этого на жгутиках происходит осаждение красителя, благодаря чему одновременно достигается как увеличение их толщины, так и уменьшение прозрачности. Одним из предложенных методов окрашивания жгутиков является метод Лейфзона. Препарат микроскопируют с иммерсионной системой. Клетки бактерий окрашиваются в красный цвет, жгутики принимают вид толстых нитей, отходящих от клетки.

Читайте также:  Анализ на свертываемость крови что показывает, как делается, сколько стоит и где можно сдать

Вопросы для самоконтроля

1 Перечислите основные морфологические типы клеток микроорганизмов.

2 Охарактеризуйте схематичное строение бактериальной клетки.

3 Перечислите этапы приготовления фиксированных препаратов микроорганизмов, охарактеризуйте их.

5 Классифицируйте используемые в микробиологии красители, охарактеризуйте их.

Практическое занятие 3

Цель:ознакомление сметодикой приготовления фиксированных препаратов, простыми и сложными методами окраски; ознакомление с морфологией и цитологией различных микроорганизмов.

Материалы и оборудование: микроскопы биологические, предметные и покровные стекла, спиртовки, бактериальные петли, иммерсионное масло, стерильные пипетки, пинцеты, фильтровальная бумага, спички, палочки ватные гигиенические, маркеры, стерильные чашки Петри, на группу – в 50 мл колбе стерильная водопроводная вода, дистиллированная вода для промывки, промывалки, кюветы, мостики, набор готовых растворов красок в штативе, спирт 96 0 , пипетки, настои из естественных материалов: мяса, гороха и т.д.

Ход работы

1 Рассмотреть разнообразие форм прокариот на рисунке 3.2. Описать морфологию всех представленных форм согласно схеме таблицы 4.1. Оформить таблицу в тетради.

Рисунок 3.2 – Разнообразие форм прокариот

Таблица 3.1 – Морфология клеток микроорганизмов

№ п/п Рисунок микроорганизма Форма клетки, сочетание

2 Рассмотреть рисунок 4.1. Определить указанные под номерами структуры бактериальной клетки. Зарисовать схему в рабочей тетради, сделать соответствующие записи названий.

3 Ознакомиться с этапами и техникой приготовления фиксированных препаратов микроорганизмов.

4 Составить схему простого метода окрашивания.

5 Составить схему окрашивания препаратов по методу Грама.

6 Приготовить фиксированный препарат с использованием простых методов окраски.

7 Приготовить фиксированный препарат по методу Грама.

8 Препараты микроскопировать с объективами 10х и 100х.

9 Охарактеризовать особенности морфологии клеток микроорганизмов согласно схеме таблицы 3.2, записать в рабочую тетрадь. Выполнить рисунки, под рисунком указать увеличение микроскопа.

Таблица 3.2 – Некоторые особенности морфологии клеток

Параметры Характеристика
Состав среды, объект исследования
Возраст культуры
Форма клеток
Сочетание клеток
Окраска по Граму
Рисунок клеток
Выводы:

10 Указать в выводах наблюдаемое разнообразие прокариот; преимущества использования в работе фиксированных препаратов.

1 Борисов, Л. Б. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии / Л. Б. Борисов [и др.]. – М.: Медицина, 1984. – 256 с.

Выделение и идентификация микроорганизмов; учебно-методическое пособие / Р. А. Желдакова. – Мн.: БГУ, 2003. – 36 с.

3 Микробиология: методические рекомендации к лабораторным занятиям и контроль самостоятельной работы студентов / В. В. Лысак, Р. А. Желдакова. – Мн.: БГУ, 2002. – 100 с.

4 Павлович, С.А. Микробиология с вирусологией и иммунологией / С.А. Павлович. – Мн.: Вышэйшая школа. 2008. – 799 с.

5 Практикум по микробиологии /А. И. Нетрусов [и др.]. – М.: Академия, 2005. – 604 с.

6 Теппер, Е. З. Практикум по микробиологии / Е. З. Теппер [и др.]. – М.: Колос, 1979. – 216 с.

Учебное издание

КОНЦЕВАЯ Ирина Ильинична

МИКРОБИОЛОГИЯ:

Практическое руководство

по изучению раздела «Морфология и структурная

организация бактериальной клетки»

для студентов специальности 1–31 01 01-02

«Биология (научно-педагогическая деятельность)»

Подписано в печать . Формат 64х80 1/16.

Бумага офсетная. Ризография. Усл.-печ.л.

Уч.-изд.л. Тираж экз. Заказ №

Издатель и полиграфическое исполнение:

«Гомельский государственный университет

имени Франциска Скорины»

ул. Советская, 104, 246019, г. Гомель

Последнее изменение этой страницы: 2016-09-19; Нарушение авторского права страницы

Ссылка на основную публикацию
Строение и функции гемоглобина
Особенности определения гемоглобина в крови, основные методы диагностики и лечения патологических состояний Общеклинический анализ крови – это первоочередное исследование, назначаемое...
Стоматологическая клиника Дарьял на улице Пришвина — отзывы, адрес и телефон, режим работы — Компьют
Стоматология Дарьял Хотела посмотреть внимательно на их сайт, а туда нужен логин и пароль, опции зарегистрироваться нет, видимо вход только...
Стоматологический инструмент для лечения зубов — центр стоматологии «Тихонова» в Туле
Презентация на тему Стоматологические инструменты Презентация на тему Стоматологические инструменты, предмет презентации: Медицина. Этот материал содержит 12 слайдов. Красочные слайды...
Строение и функции глаза, анатомия глаза
Новая теория, как мозг строит модель мира Это прорывной шаг к построению сильного ИИ Что вы видите на этой картинке?...
Adblock detector